UNIVERSIDAD NACIONAL DE JUJUY FACULTAD DE INGENIERÍA QUIMICA ORGANICA TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE JUJUY FACULTAD DE INGENIERÍA QUIMICA ORGANICA TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO ESTEROLES NOCIONES TEORICAS Esteroides Los esteroides forman un grupo de compuestos cíclicos que pueden ser considerados derivados de un hidrocarburo, que es la estructura esencial común a todos ellos, formado por la fusión de un ciclopentano con un fenantreno saturado: CICLOPENTANO PERHIDRO FENANTRENO. Ese es el esqueleto básico, los distintos compuestos están dados por la introducción de diversos átomos y grupos en diferentes posiciones que determinan las características específicas, funcionales y estructurales de cada sustancia. Los anillos del ciclopentano perhidrofenantreno se designan con las letras A, B, C y D, y los carbonos se numeran de 1 a A B 12 C D En los esteroides naturales el núcleo de ciclopentanoperhídrofenantreno posee siempre dos grupos metilos en la C- y 13, que se denominan metilos angulares (son excepción las hormonas sexuales femeninas del grupo de los estrógenos, que no tienen metilo en C-) C D A B Este hidrocarburo con los metilos angulares tiene 6 carbonos a simétricos (C-5, C-, C-8, C-9- C-13, C-14), como son todos distintos, el número de esteroisómeros posibles es 2º= 64, pero en general los esteroides naturales se diferencian sólo en la estereoidomeria de los C- 5 y C-. Clasificación de los esteroides Pueden ser clasificados en: a) Esteroles b) Ácidos biliares c) Hormonas sexuales masculinas d) Hormonas sexuales femeninas e) Corticoesteroides adrenales f) Vitaminas D (antirraquíticas) g) Saponinas h) Glicósidos cardíacos. Esteroles Los esteroles son alcoholes secundarios naturales, del grupo de los esteroides, es decir derivados del ciclopentano perhidro fenantreno. Características estructurales comunes de los esteroles. Son alcoholes sólidos de 27 a 29 átomos de carbono. En ello existe siempre un grupo oxhidrilo unido al C-3. Otra característica común es la presencia de una cadena alifática larga (de 8-11 C) unidad al C-17, en esta cadena lateral pueden insertarse radicales metilo (serie ergostano) o etilo (serie estigmastano) particularmente en C-24. También puede haber presente dobles enlaces en los anillos o en la cadena lateral. Los saturados se denominan más apropiadamente estanoles y los insaturados, estenoles. Clasificación Se los puede dividir en: a) Zooesteroles (de origen animal) b) Fitoesteroles (de origen vegetal) Localización Están muy distribuidos en los reinos animal y vegetal, donde pueden existir libres, o, con frecuencia en forma de ésteres de ácidos grasos superiores. En particular en los vegetales también se pueden encontrar como glicósidos. Se han hallado en todos los órganos de las plantas, especialmente en las semillas. Esteroles en Algas, Levaduras y Hongos. El ergosterol se encuentra en las levaduras, en el cornezuelo del centeno y en el hongo, neurospora. Es importante porque con irradiación u.v. produce la vitamina D 2 (calciferol). El fucosterol se encuentra en las algas ergosterol 5 6 fucosterol Esteroles vegetales Los principales esteroles de los vegetales, superiores poseen 29 átomos de carbono. Entre ellos están: el estigmasterol (en el aceite de soja), el Δ 7 - estigmasterol (en el aceite de germen de trigo), espinasteroles (en las espinacas y coles) y sitosteroles en muchas plantas. C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 estigmasterol α -espinasterol sitosterol Esteroles animales El lanosterol es un esteroide animal de gran importancia que interviene en gran proporción en los esteroles de la grasa de la lana. El lanosterol, también se encuentra, aunque en pequeñas cantidades en el hígado y en la levadura, siendo un producto intermediario en la síntesis del colesterol. Otros de los esteroles animales, son: el 7-dehidrocolesterol, que es un precursor de la vitamina D 3 ; el hidrocolesterol, que se encuentra en los tejidos junto con el colesterol; el coprosterol, presente en las materias fecales. El más importante de los esteroles de los animales es el colesterol del cual luego hablaremos. Lanosterol H Dihidrocolesterol H Coprosterol Aislamiento Para aislarlos se hace en general una extracción del vegetal con disolventes no polares (como el éter de petróleo y el disulfuro de carbono) o semipolares (cloroformo, éter etílico). El extracto contiene esteroles y sus esteres, además de otros lípidos, carotenos y carotenoides. Para separarlos se saponifica el extracto, y luego se extraen de la solución con un disolvente no polar. Para separarlos después de la fracción insaponificable se pueden usar distintos métodos: cristalización fraccionada, cromatografía, o (si tienen, un OH en C-3) la precipitación con digitonina (ver más adelante esta ultima técnica) Si estuviesen como glicósidos debe usarse alcohol u otros disolventes polares para la extracción. COLESTEROL Fórmula estructural: El colesterol tiene la siguiente estructura: A B C H 17 D Colesterol Tiene 27 átomos de carbono, una instauración 5-6, un -OH en C-3. Las líneas continuas indican enlaces que se proyectan por encima del plano de la molécula. Las líneas discontinuas representan a los enlaces que se proyectan por debajo del plano. Propiedades. Es una sustancia blanca, que se puede cristalizar del alcohol caliente en placas rectangulares. La porción no hidroxílica de la molécula, tiene carácter hidrocarbonado estricto, lo que explica las características de solubilidad del colesterol, semejante a la de los lípidos. Es insoluble en agua, pero puede dar soluciones coloidales al dispersarse en ella. Es soluble en alcohol caliente, en éter, en cloroformo, en benceno. También es soluble en las grasas y en soluciones acuosas que contienen bilis. El doble enlace entre los C-5 y C-6 puede experimentar las reacciones típicas de los alquenos, pudiendo fijar, por ejemplo, dos átomos de hidrogeno a dos átomos de halógeno. Localización en organismos vivos, El colesterol es el esterol típico del reino animal, no se encontró en los vegetales. El organismo animal puede sintetizar colesterol a partir de pequeños fragmentos, como el ácido acético. Abunda especialmente en el cerebro, en el tejido nervioso, en las glándulas suprarrenales, en la yema de huevo. Forma parte de los cálculos biliares, de donde se aísla por primera vez. Existe en pequeñas cantidades en todos los tejidos y en la sangre, pudiendo hallarse al estado libre o esterificado con ácidos grasos. En los tejidos extranerviosos (incluido el plasma sanguíneo) se presenta en la forma de ésteres de ácidos grasos. El plasma humano contiene unos 200 mg de colesterol por 0 ml. del cual solo aproximadamente la cuarta parte es colesterol libre. En el sistema nervioso central casi todo el colesterol esta en estado libre y aun no es clara su función. También existe, como se dijo, en las glándulas endocrinas y en la corteza suprarrenal, probablemente allí el colesterol sea el compuesto a partir del cual se sintetizan las hormonas esteroides. Reacciones del colesterol Varias de las reacciones coloreadas que luego se tratan también son comunes a otros esteroles, pero ocurre que en los tejidos animales hay cantidades relativamente pequeña de otros esteroles distintos del colesterol. Los esteroles no dan estas reacciones de color. Algunos esteroles vegetales, como el estigmasterol, el sitosterol y el ergosterol, también forman precipitados correspondientes a moléculas complejas al ser tratados con digitonina. a) Reacción de Liebermann - Burchard En esta prueba, una solución del colesterol en cloroformo reacciona con anhídrido acético y H 2 SO 4 y produce una sucesión de colores: violeta fugaz que pasa al azul y finalmente al verde intenso *. No se ha dilucidado aún el carácter de la reacción; se supone que es específica para los esteroles no saturados en C-5 y 6. Esta reacción también se emplea para la determinación cuantitativa del colesterol, sobre todo en sangre. En fecha reciente el colesterol se investigo por el color purpurino que produce con las sales férricas en sulfúrico. *El color obtenido al final, verde a verde azulado, varia de intensidad con la cantidad de colesterol presente. Esta reacción de Liebermann -Burchard es típica de los esteroles no saturados, pero no es específica del colesterol. Tiene cierto valor de diagnostico si se toma en cuenta el orden y tiempo de aparición del color (0, 1, 5, 20, 60 minutos); así, una coloración amarilla después de 15 parece corresponder a en C-14 y una Δ 7 instauración. b) Reacción de Salkowsky Consiste en mezclar el esterol con cloroformo y H 2 SO 4 (c), los líquidos quedan separados. En la zona de contacto aparece un anillo coloreado y agitando se observa que el cloroformo se tiñe de rojo intenso y el ácido sulfúrico adquiere una fluorescencia verde. En los esteroles, en general, aparecen colores de la gama del amarillo y/o del rojo. c) Reacción de Rosenheim El colesterol se calcula suavemente con un exceso de ácido tricloroacético al 90% (en solución acuosa). La señal positiva es la aparición de una coloración rojiza. Para los esteroles que sean dienos nucleares se produce una coloración violeta que vira azul después de 20. d) Reacción de colesterol y digitonina Una solución de colesterol forma con digitonina (C 56 H 92 O 2 ) un complejo insoluble: un digitónido del colesterol. Esta reacción no sólo, constituye un ensayo cualitativo, sino que también es la base de una determinación cuantitativa. El digitónido del colesterol es un precipitado blanco muy insoluble. Es condición necesaria para que ocurra la reacción que el OH del C-3 esté libre. e) Reacción con iones férricos Actualmente se emplea un método para el dosaje del colesterol en suero que tiene algunas ventajas con respecto al tradicional de Lieberman Burchard. Se extrae el colesterol del suero con reactivo acético-férrico-cítrico. A medida que se va agregando el reactivo, el medio ácido separa el colesterol de sus uniones proteicas y él queda en solución. Al seguir agregando precipitan las sustancias no lipoides. El colesterol es luego oxidado cuantitativamente por el Fe 3+ en medio H 2 SO 4 a un compuesto cromógeno púrpura que se puede medir fotocolorimétricamente a 560 nm. PARTE EXPERIMENTAL A) AISLAMIENTO DE ESTEROLES A PARTIR DE MATERIALES VEGETALES Y ANIMALES A 1 ) Aislamiento de colesterol del hígado vacuno. Se corta y se desmenuza 0 g de hígado fresco (vacuno o de cerdo) en un mortero, luego se hace una extracción con 4 porciones de 50 ml. de metanol cada una y se pasa cada fracción extraída a un balón de 1 L. Se añade luego 25 g de KOH y se calienta a reflujo a 80-85º C durante media hora (el tiempo se mide a partir de la T=80 C). El líquido que se obtiene, se extrae en una ampolla de 500 ml utilizando como solvente de extracción éter de petróleo haciendo 3 extracciones de 0 ml cada una. El extracto étereo se lava 2 veces con agua salada (cada lavado con 0 ml) y se seca con 2 gramos de sulfato de sodio anhidro durante 30 minutos como mínimo. Se evapora el solvente (llevar a la estufa si fuera necesario) y se cristaliza el colesterol impuro. Se lo purifica recristalizándolo en etanol. A 2 ) Aislamiento de colesterol de la yema de huevo. Hervir 5 minutos el huevo. Aplastar la yema de un huevo duro y pesar 1 g de yema. Colocarla en un tubo de ensayo de 20 ml y añadirle ml de una mezcla formada por 3 volúmenes de etanol 95º y 1 volumen de cloroformo. Mezclar todo bien y colocar un tapón con tubo de seguridad para eliminar los gases. Hervir 2 minutos suavemente y con cuidado con la llama del mechero y dejar enfriar. Si es necesario, recuperar el volumen con más solvente. Filtrar y al filtrado, evaporarlo a sequedad en una cápsula de porcelana. Extraer el residuo añadiendo 3 ml de cloroformo en la cápsula y repartir ese volumen en tres tubos de ensayo para aplicar los ensayos químicos cualitativos que se dan a continuación: REACCIONES COLOREADAS a) Reacción de Libermann-Burchard A 1 ml de la solución clorofórmica colocada en un tubo de ensayo, añadir igual volumen de anhídrido acético y 5 gotas de H 2 SO 4 ( c ). Observar el color que aparece a los pocos segundos. b) Reacción de Salkowsky Se coloca en un tubo 1 ml de la solución clorofórmica del esterol al 0,5%, se inclina dicho tubo y se agrega por las paredes, lentamente, 1mL de H 2 SO 4 (C) evitando que ambos líquidos se mezclen. Observar el color de la interface. Agitar y luego volver a observar. c) Reacción de Rosenheim A 1 ml de la solución clorofórmica contenida en un tubo de ensayo, agregar 1mL de ácido tricloroacético al 90% en agua. Observar a medida que transcurre el tiempo durante 25 y anotar cualquier cambio de color. A otro ml de la solución clorofórmica agregar 1 ml de ácido tricloroacético y calentar. Observar si se produce aparición de color. NOTA: Para el colesterol obtenido del hígado, se disuelven 25 mg del esterol en 5 ml de cloroformo, (obteniéndose una solución clorofórmica al 0,5 %). Y se aplican las reacciones de caracterización. ANEXO: A 3 ) Aislamiento de esteroles de las ceras de las hojas Saccharum officinarum. Se saponifica 0 g. de cera de hojas de Saccharum officinarum con 500 ml de KOH al 15% en metanol. Se refluja 1hora y luego se añaden 500 ml de agua, se calienta la mezcla otro poco y luego se extrae con 1,1 litros de benceno : éter etílico (1;1). Los extractos se lavan con agua, se secan con sulfato de sodio anhidro y luego se elimina el disolvente. Se obtiene aproximadamente 22 g. de insaponificable. Este material se extrae con 7 ml de benceno, obteniéndose unos 7,7 g. de una mezcla de esteroles. Para separar los componentes, se realiza una cromatografía en columna rellena con gel de sílice, eluyéndose diferencialmente. Se logran separar: β-sitosterol-24-etilidenlofenol; 24-metilenlofenol, estigmasterol y campesterol. A 4 ) Aislamiento de estigmasterol a partir del aceite de soja. A 8,2 g. de aceite de soja se añaden 40 ml de metanol y 7,5 g de KOH; esta mezcla se refluja durante 3 horas. Después, se le añaden 20 ml de agua y la solución se extrae con 3 porciones de 30 ml de éter isopropilico. Para ello en cada ocasión se agita la mezcla jabones - éter, durante 1 hora y en seguida se sifonea o se decanta el éter. Se juntan los extractos, se lavan con solución de NaCI y se destila el disolvente sobre baño de María. El residuo (material insaponificable) se disuelve en ml de éter de petróleo y esta solución se concentra hasta saturación, luego se deja reposar 12 horas. Se recoge el precipitado de esteroles. Para aislar el estigmasterol se le da al precipitado el siguiente tratamiento: se le agregan ml de anhidrico acético y se refluja 3 horas, la mezcla se deja enfriar una noche. Se recogen los acetatos de esteroles. Para separar los acetatos de esteroles monoinsaturados de los poliinsaturados, se disuelve 0,1. g de ellos en 1 ml de éter etílico se le añaden 1,.2 ml de solución al 5% de bromo en ácido acético. Se deja reposar 1 ó 2 horas y se recogen los tetrabromuros insolubles que se lavan con éter helado y se recristalizan de cloroformo - metanol. Para desbromarlos, se añade una solución de 0 mg de zinc en polvo. La mezcla se refluja 2 horas, se filtra en caliente, se diluye con unos 3-4 ml de agua y se extrae en éter isopropílico (o etílico). La solución etérea se lava con una solución acuosa de sulfito de sodio y finalmente se destila el éter. Se recristaliza el sólido usando etanol como solvente. Por saponificación se obtiene el estigmasterol. C) CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA Los esteroles de una mezcla, pueden ser separados por cromatografía en capa delgada. Como adsorbentes pueden usarse gel de sílice G ó alúmina; pudiéndose mezclar con - 20% de AgNO 3 para incrementar la selectividad hacia los esteroles insaturada (especialmente en C- 23 ó en C-25). Como disolvente pueden usarse las siguientes mezclas: I. benceno-acetato de etilo (4:1) (v/v) II. benceno-cloroformo ( 9:1) (v/v) Los agentes cromogénicos pueden ser: I. soluciones clorofórmicas de tri y penta cloruros de Sb. II. vapores de yodo. III. reactivo de Libermann-Buchard. También puede utilizarse la observación visual con luz U.V. de placas previamente tratadas con sustancias fluorescentes. CUESTIONARIO DEL TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO DE ESTEROLES 1.-a) Qué son esteroides? b) Dentro de que gran grupo de compuestos orgánicos se los puede ubicar o se los puede considerar como derivados? 2- Explicar desde el punto de vista de relación entre estructura y solubilidad, porque la extracción de esteroles se hace con solventes no polares. 3-Durante el proceso de aislamiento. a) Qué se separa al saponificar el extracto? (dar las reacciones generales que ocurrieran) b) Qué se extrae luego con un disolvente no polar? 4-a) Cuáles son las 3 formas en que pueden presentarse los esteroles en los organismos vivos? b) Qué entiende por glicósidos? Dé ejemplos. 5-El colesterol puede encontrarse en organismos animales, libre o combinado, formando ésteres con ácidos grados: a) El colesterol es un alcohol? b) Dé la formula de un éster del colesterol con un ácido graso hipotético -( )- 2n COOH c) Puede dar positiva la reacción con digitonina en caso de que el colesterol éste como éster? 6- Señalar en la formula del colesterol cuales son los C asimétricos. Aplicando la fórmula correspondiente calcular el número de esteroisómeros ópticos posibles. 7- Las reacciones del colesterol que se mencionan en el T.P.L. son específicas de este esterol? 8- En base a qué es posible usar el método de Libermann Burchard para la determinación cuantitativa del colesterol? 9- Describir en forma de esquema el aislamiento del colesterol a partir del hígado, anotando. a) El hombre de cada operación que se realiza, ya sea reacción química o un proceso físico (diferenciando cada uno). b) La justificación de cada paso. BIBLIOGRAFIA -Niemeyer-Bioquimica-1972-Editorial Intermedica. -Deulofeu-Marenzi-Curso Quimica Biológica-Ed. El Ateneo. -Harrow-Mazur-Bioquimica básica-9º edición-ed. Interamericana. -Xorge A. Domínguez-Métodos de investigación fotoquímica 1973-Ed Limusa. S.A. -Cantarow-Schepartz-Bioquimica-4º edición- Ed. Interamericana. -Fruton-Simmonds-Bioquimica gral.-3º edición- Ed. Omega. -Guía de trabajo Practico de Química Orgánica I, Fac. de Ciencias Exactas. U.N.B.A.
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