Transgenesis, Metodos y Aplicaciones 2

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  TRANSGÉNESIS, METODOS Y APLICACIONES Daniela Flórez Agudelo1, Edwin Santiago Restrepo Bastidas1 1. Estudiantes de pregrado biología, Facultad de ciencia exactas y naturales. Universidad de Caldas, Manizales 14 Febrero de 2014 Resumen: La transgénesis como herramienta de la ingeniería genética, has sido ampliamente utilizada con el potencial de transformar todo organismo que posea material genético, desde el reconocimiento de los ácidos nucleicos hasta la primera terapia génica aplicada en humano
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  TRANSGÉNESIS, METODOS Y APLICACIONES Daniela Flórez Agudelo 1 , Edwin Santiago Restrepo Bastidas 1 1. Estudiantes de pregrado biología, Facultad de ciencia exactas y naturales. Universidad de Caldas, Manizales 14 Febrero de 2014 Resumen: La transgénesis como herramienta de la ingeniería genética, has sido ampliamente utilizada con el  potencial de transformar todo organismo que posea material genético, desde el reconocimiento de los ácidos nucleicos hasta la primera terapia génica aplicada en humanos, involucra un sin fin de procesos, descubrimientos y nuevas metodologías que actualmente envuelven las transformaciones de diversos organismos (bacterias, plantas, hongos, animales y humanos). En esta revisión se fundamenta en los métodos y aplicaciones que se obtienen a partir de estos organismos genéticamente modificados (OGM), muchos de ellos involucrados en mejoramiento nutritivo, resistencias a  plagas, vacunas comestible, la creación de proteínas recombinantes, entre otras.  Palabras clave: Transgénesis, metodología, Organismo genéticamente modificados, aplicaciones. Abstract: Transgenesis as a tool for genetic engineering has been widely used with the potential to transform the entire organism that possesses genetic material from the recognition of nucleic acids applied to the first human gene therapy, involving a myriad of processes, discoveries and new methodologies that currently involve transformations of various organisms (bacteria, plants, fungi, animals and humans). This review is based on the methods and applications derived from these genetically modified organisms (GMOs), many of them involved in nutritional improvement, resistance to pests, edible vaccines, creating recombinant proteins, among others.  Keywords: Transgenesis, metodology, genetically modified organisms, application. 1. Introducción La existencia de la creciente demanda de productos básicos para la supervivencia humana (por ejemplo: la floreciente necesidad de vacunas económicas, eficientes y seguras (Coku, 2007), aumento notorio de la necesidad de péptidos y proteínas terapéuticas (Almonacid et al., 2005), baja calidad de las tierras cultivadas llevando a malos productos (Ubalua, 2009), entre otras), ha conducido al hombre a buscar respuestas encaminadas en la manipulación genética, una de ella es la ingeniería genética. La transgénesis es una herramienta de la biotecnología moderna, es el proceso de transferencia de genes individuales entre organismos o modificación de los genes de un organismo para suprimir o añadir un rasgo deseado (Ubalua, 2009) , según Parmat et al (2011) “ La ingeniería metabólica permite el control directo sobre la maquinaria celular del organismo mediante mutagénesis o la introducción de los transgenes ”, el Cassette es una porción de ADN que contiene la información de un gen o de varios genes de interés en los cuales se busca agregarlos a un organismo con capacidades elevadas de producción y estabilidad genomica presente en la progenie como sucede en casos de plantas transformadas por  Agrobacterium tumefaciens (Shrawat et al.; 2006). Todos los seres vivos pueden sufrir procesos de transgénesis obteniendo así un organismo genéticamente modificado (OGM). Desde los primeros proceso de transgénesis (1981) en ratones (Peñaranda y Asencio, 2007), ha llevado a investigadores a usarlos para estudio del comportamiento de genes con respectos a enfermedades como la hipertensión (Stec, Davisson yCrut, 1998), algunos organismo modelos como Escherichia coli   fueron los primeros en generarles ADN recombinante (1977) para que el mismo  produzca insulina y la hormona de crecimiento reemplazando a los bovinos como antiguos productores (Castañeda et al., 2009; Garrido, 2012). Solo estos pequeños inicios generaron una gran revolución con la capacidad de transformar un sin número de organismo, encaminadas a la producción de vacunas (Coku, 2007), biocombustibles (Hannon et al, 2010 ) , biomonitores, fármacos, alimentos más nutritivos, entre otros. Estos son algunos de los alcances que en la actualidad se han logrado por medio de la transgénesis, se hará mención de alguno de ellos a lo largo de la revisión, incluyendo la historia de la transgénesis, algunos métodos transgénicos actuales en diferentes organismos (animales, plantas y microorganismos) y las aplicaciones que se tiene a partir estos OGM. 2. Historia de la transgénesis En el siglo XIX un químico llamado Friedrich Miescher encontró un nuevo compuesto, caracterizado por la presencia de fosforo y un pH ácido, a esta sustancia se denominó nucleina, posteriormente (1889) se le acuño el nombre de ácidos nucleicos (Patino, 2006; Castañeda et al., 2009; Gonzalo, 2003), años después se descubrieron las bases nitrogenadas que los forman (1844 Guanina, 1885  Adenina, 1893 Timina, 1894 Citosina y 1900 Uracilo). Ya entrando en el siglo XX exactamente en 1903 Walter Sutton mostro al cromosoma como el transportador del material genético, posteriores estudios determinaron que había herencia ligada al sexo (Thomas Morgan), que los ácidos nucleicos contenían fosfatos, pentosas y bases nitrogenadas (Aaron Theodore), que existen mutaciones producidas artificialmente, tal es el caso de los Rayos X (Herman Müller) (Patino, 2006). El principio del traspaso del Material genético se determinó parcialmente gracias al experimento de Federic Griffith (1923) que descubrió la existencia de un principio transformante, observando el fenómeno de como cepas avirulentas de la bacteria Streptococcus pneumoniae  (Rugosas) por algún motivo se volvían cepas virulentas (lisas) (Patino, 2006), no fue hasta 1944 que Oswald T. Avery y colaboradores encuentran que el principio transformante era la trasferencia de un fragmento de ADN (Castañeda et al., 2009), ya el culmen definitivo de que el ADN era el principio transformante lo lograron los esposos Martha Chase y Alfred Hershey en 1952, el cual experimentaron con el bacteriófago T2 y la bacteria Escherichia coli   demostrando al utilizar isotopos radiactivo (ADN 32 P y Proteína 35 S) que el ADN es la molécula hereditaria (Patino, 2006; Castañeda et al., 2009), en los años 50s Watson y Crick desvelan la estructura molecular del ADN en 1953 basándose en lo encontrado por Erwin Chargaff (complementariedad de las bases nitrogenadas), la controversial foto 51 realizada por R. Franklin y M. Wilkins (muestra que la estructura del ADN es repetida), entre otras (Gonzalo, 2003). Otros componentes del dogma central de la biología fueron descubiertas, tal es el caso de los tipos de ARN: el ARN ribosomal en 1952, el ARN de transferencia en 1958 y 1960-1961 el ARN mensajero, culminando con el descifrado del código genético. Ya en la década de los 70s se descubre las enzimas de restricción, se da el primer clonaje de genes en vectores (plásmidos), se produce en 1973 el primer organismo con ADN recombinante (Castañeda et al., 2009), se empieza a desentrañar los mecanismos por el cual una bacteria  Agrobacterium tumefaciens infecta a las células huéspedes (García, 2012) y en 1975 se funda la primera empresa de ingeniería genética (Genentech Incorporated) y en 1977 implanta en Escherichia coli   el gen humano de la somatotropina para que este organismo produzca las hormona de crecimiento humana (Castañeda et al., 2009; Garrido, 2012), otro gran descubrimiento en la ingeniería genética fue realizado por Sanger, Maxam y Gilbert  quienes en sus trabajos publicaron metodologías para la secuenciación de la molécula de ADN (Garrido, 2012).  A partir de todos estos descubrimientos, en 1981 mediante el uso de genes inyectados de pronúcleos de cigoto se logró una transformación estable en ratones (Peñaranda y Asencio, 2007), se presentaron los primeros reportes científicos de plantas transformadas en 1983 tales como plantas de tabaco, de petunias y girasoles (Valderrama, Isaza y Kafuri, 2005), en ese mismo año se encontraron los puntos clave para el uso de  Agrobacterium tumefaciens  en el traspaso de genes (Garcia, 2012), en 1985 Kary Mullis inventa la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) (Garrido, 2012), Sanford y colaboradores introducen en 1987 el mecanismo de bombardeo de partículas dándole el nombre de “biolistica” (Gonzales, 2013). En 1990 se dio la primera terapia génica por el Dr. French Anderson y colaboradores aplicada a una niña de 4 años (Gonzalo, 2003; Garrido, 2012). En los años 90s se empieza los procesos de secuenciación de genomas completos empezando por Haemophilus influenzae  (1995), de Saccharomy cescerevisiae  (1996), del gusano Caenorhabditis elegans  (López, 2008) y logrando en 2003 donde tanto entidad pública (Francis Collins) como privada (Craig Venter) secuencian el genoma humano, posteriormente en 2010 se sintetizo químicamente un organismo Mycoplasma capricolum (Garrido, 2012). 3. Tipos de transgénesis, métodos y aplicaciones 3.1. Transgénesis en microorganismos Los microorganismos para convertir los carbohidratos, compuestos lignocelulosicos y otros desechos en alimentos ricos en proteínas son eficientes debido a su capacidad de crecimiento rápido, ser fácilmente modificados genéticamente, crecer en diferentes ambientes (suspensiones o en sólidos) además de presentar altos contenidos de proteínas entre el 35 al 60% (Ubalua, 2007). Estas grandes características llevo a que estos organismos fueran el primer foco de atención para procesos de transformación genética. Generalmente los procesos de transformación en microorganismo se dan por electroporación y agentes químicos con choque térmico (Figura 1).Actualmente para organismo recalcitrante como Streptococcus mutans  los aminoclays han sido exitosos para transformarlos (Choi et al, 2013).   El proceso de electroporación consiste en la formación de poros en la membrana del organismo de interés, generado por un choque eléctrico de corta duración, que en consecuencia aumenta la permeabilidad de la membrana permitiendo que el ADN de interés (plásmido) entre a la célula, es un proceso reversible. Las células electrocompetentes (cepa) y los plásmidos con los genes de interés son colocados en celdas de electroporación, en condiciones específicas (Reyes et al., 2010). El principal problema con este método es la presencia de alta mortalidad celular (Li et al., 2007). En la transformación por choque térmico, el objetivo radica en aumentar la temperatura abruptamente aproximadamente a 42 °C (Sha et al., 2011). Según Li et al (2007) “dos elementos claves se utilizan en la transformación del ADN por choque térmico: primero es que las células bacterianas hayan sido tratadas previamente con CaCl 2 , para hacer la membrana celular más permeable y segundo un ADN circular recombinante (plásmido), un ADN circular con el gen diana a  ser transferido dentro de la célula”, en este proceso el plásmido debe contener un gen de resistencia a antibióticos para la selección de cepas transformadas. Los aminoclays o 3-aminopropil filosilicatos fue un método creado en 1997, son compuestos que constan de cationes metálicos (generalmente Mg 2+  o Ca 2+ ) que son la columna vertebral de la estructura la cual esta intercala por grupos amino unido por enlaces covalente. Estos animoclays forman un complejo con el plásmido (complejo ADN-aminoclay) lo cual facilita la penetración del plásmido por la membrana del organismo. Esta técnica es más efectiva cuando el catión tiene menor tamaño, además que es útil para transformar cepas nativas, como es el caso de Streptococcus mutans  (Choi et al, 2013). Bacteria Plásmido Poro Electroporación Choque térmico 42 °C  Ambas técnicas generan poros reversibles en la membrana, vía de entrada para los plásmidos. Se obtiene las bacterias con el plásmido de interés Figura 1 Métodos de transformación en microorganismos. Cassette
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