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  Allplex TM Panel Respiratorio 1 (Flu / VSR / Subtipificación Flu A) (Cat. No. RP9801X) Sistema de PCR en tiempo real múltiplex con RT (Transcripción Inversa) en un solo paso para la detección de virus
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Allplex TM Panel Respiratorio 1 (Flu / VSR / Subtipificación Flu A) (Cat. No. RP9801X) Sistema de PCR en tiempo real múltiplex con RT (Transcripción Inversa) en un solo paso para la detección de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus sincitial respiratorio humano A, virus sincitial respiratorio humano B, y la subtipificación del virus de Influenza A (Virus de la Influenza Humana A subtipos H1, H3, y H1pdm09) en aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet Para su uso con el 1. Sistema de PCR en Tiempo Real CFX96 TM (Bio-Rad) (Uso para Diagnóstico In Vitro) Éste producto puede ser usado con propósitos IVD en países autorizados. (Únicamente para uso en investigación) Este producto debe usarse para propósitos RUO en otros países. No disponible en los Estados Unidos TABLA DE CONTENIDOS Panel Respiratorio Allplex TM 1 NOTIFICACIONES USO PREVISTO PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO ANTECEDENTES REACTIVOS MANEJO Y ALMACENAMIENTO MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO PROTOCOLO CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE RESULTADOS RESULTADOS SOLUCIÓN DE PROBLEMAS RENDIMIENTO REFERENCIAS SIMBOLOGÍA /2015 V1.03 NOTIFICACIONES Este producto se puede utilizar con propósitos IVD (Diagnóstico In Vitro) en la UE dado que la Marca IVD CE está aprobada por la Directiva de la UE (98/79/EC) y países autorizados, pero debe utilizarse para propósitos RUO (Uso Exclusivo en Investigación) en otros países. La confiabilidad de los resultados depende de la toma adecuada de la muestra, el almacenamiento, el transporte y la ejecución de procesamiento. Es posible usar el mismo ácido nucleico aislado para los Paneles Respiratorios Allplex TM 1, 2, y 3. Si la misma muestra será evaluada también con el kit del Panel Respiratorio Allplex TM 4 adicionar ambos RP-V IC y RP-B IC al ácido nucleico aislado (Véase página 12). Este producto es para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet, máximo 5 ensayos separados. Ésta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras: aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Ésta prueba no ha sido validada para otros tipos de muestras. Almacene las muestras de ADN/ARN a -20 hasta su uso y manténgalas en hielo durante su uso. La sensibilidad del ensayo puede disminuir en las muestras que son congeladas y descongeladas repetidamente o almacenadas por largos periodos de tiempo. El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder de manera unidireccional. Use siempre guantes desechables en cada área y cámbielos antes de ingresar a áreas diferentes. Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o trátelos con un reactivo descontaminante de ADN. Asigne suministros y equipos a las áreas de trabajo separadas y no los mueva de un área a la otra. No pipetee con la boca. No coma, beba o fume en las áreas de trabajo del laboratorio. Use guantes desechables libres de talco, batas de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y reactivos. Lávese bien las manos después de manipular muestras y los reactivos de la prueba. Evite contaminar los reactivos al extraer las alícuotas de los tubos de reactivos. Se recomienda el uso de puntas para pipetas estériles, desechables y con filtro resistente a aerosoles No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote. No use este producto después de la fecha de vencimiento. Todos los elementos desechables se pueden usar una sola vez. No los reutilice. 3 10/2015 V1.03 Use tubos de tapa rosca y evite las posibles salpicaduras o contaminación cruzada de muestras durante la preparación. Sea cuidadoso de no contaminar los reactivos con ácidos nucleicos aislados, productos de la PCR, y control positivo. Para prevenir la contaminación de los reactivos, se recomienda usar puntas con filtro. Use áreas separadas para cada experimento. Prepare y use un set diferente de pipetas para cada una de las siguientes áreas: aislamiento de ácido nucleico, mezcla de reactivos, la adición del ácido nucleico molde y la adición de productos de PCR. Solo en un espacio designado, abra los tubos de reacción o tiras de PCR después de la amplificación, para evitar la contaminación con amplicones. Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit. Los procedimientos de seguridad en el laboratorio (remitirse a Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos y Documentos del CLSI) se deben tener en cuenta para manipular las muestras. Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0.5% (en agua desionizada o destilada). Los componentes del producto (residuos del producto, empaque) se pueden considerar residuos de laboratorio. Deseche los reactivos no usados y los residuos de conformidad con los reglamentos federales, estatales y locales aplicables. USO PREVISTO El Panel Respiratorio Allplex TM 1 es un ensayo cualitativo in vitro para la detección simple o múltiple de virus de Influenza A (Flu A), virus de Influenza B (Flu B), virus sincitial respiratorio humano A (VSR A), virus sincitial respiratorio humano B (VSR B), virus de Influenza humana A subtipo H1 (Flu A-H1), virus de Influenza humana A subtipo H3 (Flu A-H3) y virus de Influenza humana A subtipo H1pdm09 (Flu A-H1pdm09) en muestras de aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Flu A: Los primers están diseñados en regiones conservadas en el gen matriz (M1) para detectar distintos subtipos del virus de influenza A. Con base en el análisis in silico, pueden detectar secuencias del subtipo H5N1 que causa la gripe aviar altamente patogénica, y el nuevo virus de influenza A (subtipo H7N9) de origen aviar que se detectó por primera vez en China en marzo de /2015 V1.03 Subtipos de Flu A: Los primers están diseñados en regiones conservadas del gen de la hemaglutinina (HA). Detectan casi todos y cada uno de los subtipos (H1, H3, y H1pdm09) del virus de influenza humana A. PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO 1. Principios El Panel Respiratorio Allplex TM 1 es representativo de la tecnología patentada de Seegene MuDT, la cual proporciona valores multi-ct (ciclo umbral) en un solo canal de fluorescencia sin análisis de curvas de melting en los instrumentos para PCR en tiempo real. El Panel Respiratorio Allplex TM 1 es un ensayo de RT-PCR en tiempo real multiplex en un solo paso que permite la amplificación simultánea y la detección de ácidos nucleicos objetivo de Flu A, Flu B, VSR A, VSR B, Flu A-H1, Flu A-H3, Flu A-H1pdm09 y el Control Interno (IC). En la PCR, la eficiencia de amplificación puede reducirse usualmente por inhibidores que se pueden presentar en las muestras clínicas. Por ende, el control interno (IC) es incorporado dentro del producto como un control exógeno de todo el proceso para monitorear el aislamiento de ácidos nucleicos y verificar una posible inhibición de la RT-PCR. El IC es co-amplificado con los ácidos nucleicos objetivos en las muestras clínicas. 2. Descripción General del Procedimiento Muestras (Aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares) ADN/ARN Viral Aislamiento de ácidos nucleicos RT-PCR en tiempo real en un solo paso utilizando el sistema Allplex TM Análisis de resultados Descripción general del procedimiento del Panel Respiratorio Allplex TM 1 5 10/2015 V1.03 ANTECEDENTES 1. Infección por Virus Respiratorios La Infección Respiratoria tiene dos categorías: la infección del tracto respiratorio superior y la infección del tracto respiratorio inferior. La infección del tracto respiratorio superior es causada por patógenos que invaden por vía nasal, faríngea, auris media, espenculus, etc. Cualquier infección detectada en el tracto respiratorio que se encuentre por debajo de la laringe es categorizada como una infección del tracto respiratorio inferior. Entre las infecciones del tracto respiratorio inferior, las infecciones virales pueden dividirse en cuatro grupos principales denominados, neumonía, bronquiolitis, laringotraqueobronquitis y traqueobronquitis. Las diferencias de edad para cada virus se presentan en las víctimas que se infectan. Además, los síntomas pueden diferir en pacientes que incluso tengan el mismo tipo de virus. Aunque cada virus puede causar síntomas para todos los cuatro tipos de infecciones del tracto respiratorio inferior, algunos síntomas aparecen con frecuencia en una infección específica que en otras. Por ejemplo, el VSR puede aparecer en todas las edades desde infantes a adultos, pero este causa una infección del tracto respiratorio superior en adultos y bronquiolitis en bebés. Usualmente, el VSR causa neumonía en infantes, y la mayoría de pacientes que son diagnosticados con infecciones del tracto respiratorio inferior son niños con menos de dos años, en su mayoría niños con menos de seis meses de edad. Aunque los adultos tienen buenos niveles de inmunidad por las repetidas infecciones por virus respiratorios desde su infancia, el sistema inmune es limitado, imperfecto y vulnerable a los virus respiratorios, usualmente infecciones del tracto respiratorio superior. Sin embargo, los pacientes con un sistema inmune decaído pueden desarrollar infecciones del tracto respiratorio inferior tales como neumonía. En casos de influenza, debido a que es una variación antigénica del virus, los pacientes con enfermedades subyacentes y personas mayores se infectan frecuentemente y desarrollan neumonía. Además, puede deteriorar las enfermedades subyacentes que pueden causar la muerte del paciente. Investigaciones recientes afirman que el VSR produce los mismos síntomas que la influenza. 2. Virus de la influenza El virus de la influenza (de la familia Orthomyxoviridae) presenta un genoma de ARN de cadena sencilla de sentido negativo que está presente en 8 segmentos separados de ribonucleoproteína. Esta segmentación del genoma es poco común entre los virus y muy 6 10/2015 V1.03 probablemente contribuye al rápido desarrollo de nuevas variedades de influenza, a través del intercambio de segmentos génicos entre virus diferentes que infectan la misma célula. Existen 3 tipos de virus de influenza: A, B y C. Los virus A y B son los más comunes de los tres. Sobre todo, el virus tipo A es conocido como el más común por infectar no solo seres humanos, sino también aves y varios tipos de mamíferos. Entre los virus de influenza que invaden seres humanos, el H1N1 y H3N2 se están convirtiendo en un problema por infectar niños y personas mayores. Los tipos B y C se limitan a afectar solamente a seres humanos. Los primeros síntomas por influenza son descarga nasal, congestión nasal, dolor de garganta, tos, fiebre, nasofaringitis o síntomas similares por rinitis aguda, escalofríos, y dolor muscular, los cuales son más graves que el resfriado común. Específicamente, los síntomas de influenza causan alta fiebre y desarrollan complicaciones debido a infecciones bacterianas. 3. Virus Sincitial Respiratorio (VSR) El virus sincitial respiratorio (de la familia Paramyxoviridae) es un virus envuelto de un genoma de ARN de cadena sencilla de sentido negativo. El VSR tiene una alta frecuencia de ocurrencia entre otras enfermedades respiratorias. Está caracterizado como clínicamente significativo por causar muertes en bebés con malformaciones cardíacas congénitas, infantes prematuros, y bebés con cirugía de corazón abierto reciente. La bronquiolitis es el tipo más común de infección de VSR en infantes, pero no aparece tan a menudo después de un año de edad. Por otro lado, la neumonía es un problema para todos los infantes. El VSR es el responsable de desarrollar el 45~75% de bronquiolitis, el 15~25% de neumonía en infantes, y 6~8% de laringotraqueobronquitis. El VSR era originalmente conocido como patógenos que desarrollaban enfermedades en bebés, pero estudios recientes demuestran que el VSR que se presenta en adultos puede producir resultados tan graves como la influenza, tales como la transferencia y muerte. Además, si los pacientes que tienen el sistema inmune decaído (que se hayan sometido a trasplante de médula ósea o trasplante de órganos sólidos) son infectados por el VSR que causa neumonía, la probabilidad de que se produzca la muerte es de un 50%. 4. Influenza Estacional La influenza estacional es una infección viral aguda causada por un virus de influenza. Los virus de influenza tipo A se dividen además en subtipos de acuerdo a las clases y combinaciones de proteínas superficiales virales. Entre muchos subtipos de virus de influenza 7 10/2015 V1.03 A, los subtipos H1N1 y H3N2 son los más recientes que están circulando entre los seres humanos. Los virus de influenza circulan en todo el mundo. Los casos de virus de influenza tipo C ocurren con mucha menor frecuencia que los de tipo A y B. Esa es la razón por la cual solamente los virus de influencia A y B están incluidos en las vacunas de influenza estacional. Las epidemias de influenza ocurren cada año en otoño y en invierno en las regiones templadas. Las enfermedades causan hospitalizaciones y muertes, principalmente entre grupos de alto riesgo (infantes, personas mayores o enfermos crónicos). En todo el mundo, estas epidemias anuales causan cerca de tres a cinco millones de casos de enfermedades graves, y aproximadamente de a muertes. La mayoría de muertes asociadas a la influenza en países industrializados se presentan en las personas de 65 años o más. 5. Subtipo H1N1 del virus de Influenza A de origen porcino (H1pdm09) El H1N1, un subtipo del virus de influenza A, es la causa más común de influenza (gripe) en los seres humanos. Algunas cepas de H1N1 son endémicas y también son responsables de una pequeña parte de todas las enfermedades similares a la influenza y de una gran parte de toda la influenza estacional. Por ejemplo, en 2006, las cepas H1N1 causaron aproximadamente la mitad de todas las infecciones humanas de gripe. Otras cepas de H1N1 son endémicas en cerdos (influenza porcina) y en aves (influenza aviar). En junio de 2009, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró que una nueva cepa de origen porcino H1N1 era la responsable de la pandemia de gripe de 2009 y elevó el nivel de alerta a la fase 6; esta era la primera pandemia global desde la gripe de Hong Kong de Esta cepa es denominada comúnmente como gripe porcina por los medios públicos de comunicación. Se descubrió que el origen porcino H1pdm09 aislado de los pacientes en Estados Unidos estaba compuesto de elementos genéticos de cuatro virus de gripe distintos - influenza en Norteamérica y México, influenza aviar de Norteamérica, influenza humana y el virus de la influenza porcina encontrado por lo general en Asia y en Europa: una mezcla inusualmente mestiza de secuencias genéticas. Esta nueva cepa parece ser el resultado de un intercambio de virus de influenza humana y porcina, en todas las cuatro diferentes cepas del subtipo H1N /2015 V1.03 REACTIVOS Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 50 reacciones. Información de pedido ( RP9801Y) Panel Respiratorio Allplex TM 1 Símbolo Contenido Volumen Descripción 5X RP1 MOM Enzima para tiempo real en un solo paso Buffer 5X para tiempo real en un solo paso RP1 PC 500 μl 200 μl 500 μl 80 μl Mezcla de Oligos MuDT (MOM): - Reactivo para la amplificación y detección Mezcla de enzimas para la RT-PCR en un solo paso. Buffer para RT-PCR en un paso Buffer que contiene dntps. Control Positivo (PC): - Mezcla de patógenos y clones de IC RP-V IC Agua libre de RNasas 1000 μl μl Control Interno Exógeno (IC) para el Panel Respiratorio Allplex 1, 2, y 3 Control Negativo (NC) grado PCR de calidad ultrapura: - Agua esterilizada como control negativo Manual de usuario Allplex TM es una marca registrada de Seegene Inc. MANEJO Y ALMACENAMIENTO Todos los componentes del Panel Respiratorio 1 Allplex TM deben almacenarse a -20 C. Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. El congelamiento y descongelamiento repetido debe evitarse ya que podría disminuir la 9 10/2015 V1.03 sensibilidad. Si los reactivos serán usados de manera intermitente, deberán almacenarse en alícuotas. MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO Guantes desechables libres de polvo (látex o nitrilo). Pipetas (ajustables) y puntas estériles. Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml. Kit para aislamiento de ácidos nucleicos. Máquina de hielo. Centrífuga de mesa. Agitador vórtex. Equipo para PCR en tiempo real CFX-96TM (Bio-Rad). Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0.2 ml sin tapas (color blanco, No. Cat. TLS0851, Bio-Rad) Tiras de 8 tapas planas de grado óptico (No. Cat. TCS0803, Bio-Rad) Plato de 96 pozos, pozo blanco. (cat. No. HSP-9655, Bio-Rad) 10 10/2015 V1.03 PROTOCOLO 1. Toma de muestra, almacenamiento y transporte Nota: Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos. Sólo las muestras que sean recogidas, transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente las siguientes normas e instrucciones, serán permitidas: Nota: Para garantizar una alta calidad de las muestras, se deben transportarse lo más rápidamente posible. Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de temperatura indicadas. A. Toma de muestra Aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, lavado broncoalveolar Las muestras de aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, y el lavado broncoalveolar son examinadas rutinariamente para patógenos respiratorios comunes. La obtención de las muestras puede ser difícil en algunos pacientes. En tales casos, el hisopado nasofaríngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon (COPAN, Italia) y en el medio universal de transporte (UTM). Manufacturer Specimen collection device Cat. No. COPAN ESwab 482CE COPAN ENAT PM 2ML PERNASAL APPLICATOR 606CS01P COPAN UTM con hisopos flocados 360C / 305C DIAGNOSTIC HYBRIDS UTM con hisopo flocado de minipunta flexible 403C / 406C Nota: Recomendaciones del kit de ácidos nucleicos para el MICROLAB NIMBUS IVD o MICROLAB STARlet. SE RECOMIENDA ESPECIALMENTE SEGUIR LAS SIGUIENTES INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE. 1. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos o para virus para muestras clínicas tomadas en UTM. 2. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos para muestras clínicas tomadas en ESwab. 3. Utilice el kit STARMag 96 para virus para muestras clínicas tomadas con ENAT. B. Almacenamiento y transporte de muestras 11 10/2015 V1.03 Muestra Aspirado Nasofaríngeo Almacenamiento y Transporte Temperatura Duración* Nota - El desempeño podrá afectarse por el almacenamiento Hisopado Nasofaríngeo 2~8 C. 3 días. prolongado de las muestras. - Las muestras deben ceñirse a las instrucciones locales y Lavado broncoalveolar nacionales para el transporte de material patogénico. * Duración: Muestras tomadas de la prueba antes del periodo. 2. Aislamiento de ácidos nucleicos Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de ácidos nucleicos. Use el protocolo correcto de acuerdo al protocolo del fabricante. Los siguientes kits han sido validados para uso con este kit. A. Control Interno Nota: IC está incluido en el kit para permitir a los usuarios confirmar no solamente el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos sino también identificar cualquier inhibición de la RT-PCR. Se deben añadir 10 μl de RP-V IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos. Cuando use este producto con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM 4, debe agregar 10 μl de RP-V IC y 10 μl de RP-B IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos. B. Sistema automatizado para el aislamiento de ácidos nucleicos B-1. MICROLAB NIMBUS IVD Nota: Por favor use las muestras y los volúmenes de elución como se indica abajo. Para todos los demás, refiérase al protocolo del fabricante /2015 V1.03 Sistema automatizado para el aislamiento Fabricante Cat. No. Vol. recomendado MICROLAB NIMBUS IVD Hamilton * - STARMag96 Virus Seegene Muestra
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