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MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO A partir del total del plantel de reproductores del Centro Piscícola El Ingenio (Foto 1) se escogieron cuarenta peces hembras a las cuales le faltaban aproximadamente 30 días para su primera ovulación. Estas hembras primerizas se caracterizaron por presentar el poro genital notoriamente vascularizado (Blanco, 1995). Diez de ellas se emplearon en la maduración final de los ovocitos in Vitro. Las otras 30 participaron en la maduración final de los ovocitos in Vivo. Los peces fueron alimentados con alimento balanceado tipo reproductor pigmentante a razón de tres veces al día, at livitum, según la tabla de alimentación manejada por la piscigranja. El suero se obtuvo de la sangre de diferentes peces hembras en estadíos previos o posteriores a la ovulación. Todas las muestras fueron obtenidas bajo la colaboración del Centro Piscícola El Ingenio, entidad que pertenece a la Dirección Regional de Pesquería del Consejo Transitorio de Administración Regional CTAR-Junín, durante los meses de Julio a Noviembre de 2001 y desde Julio a Octubre de 2002, tiempo que corresponde a las estaciones de invierno y primavera. El invierno se caracterizó por tener un clima seco con intensa radiación solar mientras que la primavera fue un período de grandes precipitaciones acuosas e intensa nubosidad. La temperatura ambiental promedio en ambas estaciones fue de 11 C en el agua y de 12ºC a 14ºC en el aire. PREPARACIÓN DEL ESTANQUE Se emplearon tres estanques de crianza de 9 x 2 x 1.2 m los cuales se limpiaron eliminando el detritus y las algas de las paredes y del piso. A continuación, con una preparación de cal viva disuelta en agua se encaló todo el estanque. Al secar se desinfectaron pisos y paredes con solución yodada 100ppm (Blanco, 1995). Al día siguiente se abrió la entrada de agua por espacio de una hora para desechar los remanentes de yodo. Una vez hecho esto los estanques estuvieron listos para recibir a los peces. El destino de los estanques fue como sigue: llamaremos A al estanque donde se criaron a los peces control del ensayo in Vivo, B y C a los estanques donde se mantuvieron a los peces problema. ANESTESIA DE LOS PECES Se prepararon 40 litros de una solución de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol o clorobutanol de 600mg/ml (Stosskopf, 1993) en una batea de plástico (Summerfelt, 1990). Sólo un pez fue colocado en esta batea cada vez que fueron anestesiados los animales, y la solución siempre fue recientemente preparada. El tiempo de inducción (desde que el pez fue colocado en la solución hasta que el pez empezó a mostrar el vientre, Foto 2) fue de 38.3seg en promedio y el de recuperación (desde que el pez estaba sedado hasta que éste recuperó la capacidad de nado, Foto 3) fue de 218.3seg para peces que en promedio pesaron g (Flores, 2002). La predicción del tiempo de inducción fue realizada basado en el peso de los peces, por medio de un modelo matemático (Ramos, comunicación personal) el cual fue: y = x Donde: y = tiempo de inducción expresado en segundos. x = peso expresado en gramos = valor del tiempo de inducción cuando el peso es nulo = coeficiente de regresión, indica la variación del tiempo de inducción cuando el peso se incrementa en un gramo. OBTENCIÓN E INACTIVACIÓN DEL SUERO A partir de peces anestesiados se extrajo la sangre de la arteria caudal (Sunyer et al, 1998) con una jeringa de 5ml provista de aguja heparinizada 21G-1/2. La sangre fue transferida cuidadosamente hacia diferentes tubos de prueba de vidrio de 10 x 1.2 cm. El suero se separó mediante centrifugación a 2000rpm por 15 min (Sunyer et al, 1996). En los cultivos in Vitro, se utilizó suero inactivado a 30 C por 30min (Flores, 2002). Los sueros se almacenaron en refrigeración a 4 C en tubos de prueba de vidrio de 10 x 1.2cm sellados con parafilm (Sunyer et al, 1997). PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y ESTERILIZACIÓN El medio de cultivo Leibovitz L-15 se resuspendió en un litro de agua bidestilada estéril, agregándose 10mg de sulfato de estreptomicina, 50mg de bencilpenicilina y 1.2g de bicarbonato de sodio (Patiño y Thomas, 1990b). Se esterilizó por filtración con membrana de 0.45?m Gelman Sciences. Se guardó en refrigeración a 4 C (Sretarugsa y Wallace, 1997). La hormona gonadotrofina coriónica humana fue resuspendida según las indicaciones del fabricante y posteriormente fue alicuotada con micropipeta de capacidad entre 40 a 200?l en viales tipo eppendorf a razón de 100UI por cada vial y confinadas en refrigeración de 2ºC a 15 C. Para fines del cultivo se acondicionó una habitación estéril en la cual pisos y mesas se limpiaron con alcohol de 96, habían mecheros que funcionaban con alcohol de 70 y un mechero de Bunsen. La indumentaria del operador consistió de botas, mandil, gorro y mascarilla de tela previamente autoclavados y de guantes de látex estériles descartables. El material de vidrio y de metal se esterilizó en horno seco a 180 C por 20min, mientras que los otros materiales se autoclavaron a 121 C por 15min. La temperatura de trabajo en todo el desarrollo de la tesis fue de 11 C MADURACIÓN FINAL DE LOS OVOCITOS in Vitro Diez peces hembras fueron inyectados intramuscularmente con una sola dosis de 100UI de gonadotrofina coriónica humana (hcg) por Kg de pez, previamente el peso corporal de cada animal fue registrado. Estos peces se mantuvieron en el estanque B por 14 horas. Luego de sacrificar al animal por sobreexposición en el baño de anestesia (aproximadamente 15 min), se extrajeron ambas gónadas en una vasija de vidrio con medio de cultivo Leibovitz L-15 a partir de los cuales se probaron cuatro tipos de cultivo problema, dos de ellos utilizaron 5UI/ml (Patiño y Thomas, 1990b) y 10UI/ml (Wu et al, 2000) de hcg ambos con sólo Leibovitz L-15 (medio problema 1). Los otros dos utilizaron las mismas concentraciones hormonales pero con Leibovitz L-15 suplementado con 2% (v/v) de suero de trucha (Calvi y Maisse, 1998) y 5?g de insulina (medio problema 2. Rose et al, 1999). El cultivo control sólo utilizó medio de cultivo Leibovitz L-15 sin hormona y fue único para todas las pruebas. Todos los cultivos fueron realizados en frascos de vidrio estériles de 5 x 5cm cubiertos con papel aluminio y en todos se sembraron aproximadamente cien ovocitos con sus células foliculares circundantes (Goetz, 1983) en el estadío de vesícula germinal en migración (Foto 4), a manera de monocapa y extraídos con pinzas y bisturí No.11. Antes de iniciar el cultivo se preincubaron todas las muestras, control y problema, en medio Leibovitz L-15 por una hora. Luego las muestras fueron incluidas en sus correspondientes medios, los cuales fueron cambiados cada tres horas (Patiño y Thomas, 1990c). Desde la preincubación todas las muestras se mantuvieron en agitación constante a 80rpm y a la vez se midieron los diámetros de los ovocitos antes de la preincubación y finalizado el cultivo, haciendo uso de un micrómetro incorporado al estereoscopio. (Sretarugsa y Wallace, 1997). El desarrollo del cultivo fue programado en aproximadamente 4 días (Planas et al, 2000). ÍNDICE GONADOSOMÁTICO Después de haber sacrificado a los animales y previo al cultivo in Vitro, se registraron los pesos corporales y gonadales de los peces, los cuales fueron evaluados mediante la siguiente fórmula (Zanuy y Carrillo, 1973): Indice Gonadosomático (I.G.S.) = Peso gonadal (g) x 100 Peso Corporal (g) La disección fue efectuada al cortar longitudinal y ventralmente con tijera punta roma desde cerca al poro urogenital hasta la porción anterior del pez. Las gónadas fueron extraídas enteras con ayuda de pinzas punta roma y tijera punta fina. MADURACIÓN FINAL DE LOS OVOCITOS in Vivo Treinta peces hembras de aproximadamente 30 días previos a la ovulación fueron repartidas en los estanques A, B y C a razón de 10 peces por estanque. Los peces de estos dos últimos estanques fueron inyectados intramuscularmente con gonadotrofina coriónica humana. Las del estanque B fueron inyectadas con 20UI/Kg de peso (Tratamiento 1) y las del estanque C con 35UI/Kg de peso (Tratamiento 2). Doce horas después los peces del estanque B fueron nuevamente inyectados con 80UI/Kg de peso y las del estanque C con 115UI/Kg de peso (Bailey y Cole, 1999). A los peces del estanque A no se les administró hormona. Cada seis horas fueron evaluados los peces por masaje abdominal para detectar la ocurrencia de la ovulación. Se registraron los pesos corporales antes y después del desove. Los ovocitos producidos se contabilizaron mediante la técnica de Von Bayer (Blanco, 1995, Foto 5). EVALUACIÓN DE LA MADURACIÓN DE LOS OVOCITOS PRODUCIDOS Los ovocitos fueron evaluados antes y durante el cultivo in Vitro y luego del desove producido por la inducción in Vivo por inmersión en una solución clareante compuesta de etanol absoluto, formol y ácido acético glacial en la proporción 6 : 3 : 1 por 10 min (Bailey y Cole, 1999). En los cultivos in Vitro la evaluación se hizo cada seis horas para determinar si la vesícula germinal estaba en migración, era periférica o había desaparecido; cada evaluación constó de 10 repeticiones. Tanto los ovocitos obtenidos in Vitro como In vivo se reportaron como maduros si la vesícula germinal había desaparecido. ANÁLISIS ESTADÍSTICO En la maduración final in Vitro, fueron utilizadas la Prueba de ANOVA para dos factores (tiempo y medio de cultivo) y la Prueba de Dunnett para las comparaciones múltiples; la variación del diámetro folicular en este cultivo fue analizada por la Prueba no paramétrica de Wilcoxon. La diferencia de pesos entre las gónadas de ambos lados fue discriminada mediante la Prueba no paramétrica de Wilcoxon con dos colas. En la maduración final in Vivo, fueron utilizadas: Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y Prueba no paramétrica de Wilcoxon con dos colas. Todas las pruebas fueron desarrolladas con un nivel de significación de 0.01
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