Farmacología I Guión de Prácticas

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Farmacología I Guión de Prácticas Facultad de Química, UNAM Farmacología I Guión de Prácticas Andrés Navarrete Castro Liana Medina Cruz José Luis Balderas López Facultad de Química, UNAM Departamento de Farmacia Clave de la materia 1408 Primera Edición 2008 D.F. Ó UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, C.P , México, Distrito Fedeal. ISBN en trámite Prohibida la reproducción parcial o total por cualquier medio sin autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales. Impreso y hecho en México Este material se desarrolló con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME) con la clave PE Proyecto: Desarrollo de procedimientos para la enseñanza de la Farmacología Experimental basada en el principio de las 3Rs: Reducción, Refinamiento y Reemplazo de animales de laboratorio. El contenido de este material fue revisado por los profesores de Laboratorio de Farmacología I del semestre Índice Prácticas 1. Marco conceptual del laboratorio de Farmacología Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50 en un sistema simulado Determinación de la concentración letal 50 (CL 50 ) del dicromato de potasio en Artemia salina Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE 50 ) sedante en ratones Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano aislado...49 Apéndices Apéndice I. Tabla de conversión de proporción a unidades Probit...57 Apéndice II. Técnicas de manejo e identificación de animales de laboratorio (rata y ratón) Apéndice III. Formato de Consentimiento informado...65 Apéndice IV. Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP 1. Marco conceptual del laboratorio de Farmacología La Farmacología es una ciencia experimental por excelencia. Los métodos utilizados para evaluar la seguridad y la eficacia de los fármacos utilizan sistemas biológicos que van desde fragmentos celulares o macromoléculas aisladas hasta poblaciones enteras. En gran parte del proceso de investigación farmacológica se utilizan animales de laboratorio íntegros. Sin embargo, la creciente sensibilidad respecto a la práctica de la experimentación en animales en la investigación y en la enseñanza de las Ciencias Biomédicas, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos de la misma son parte de un debate actual (Jukes y Chiuia, 2003). La utilización de animales de experimentación en la enseñanza de las prácticas de diferentes asignaturas de las Ciencias Biomédicas y en especial de la Farmacología, ha venido siendo la metodología más empleada por todos los profesores de esta disciplina. Gracias a la utilización de estos animales, los estudiantes han podido apreciar los diferentes efectos y los principios de la acción farmacológica. Entre las prácticas clásicas que se han realizado en la mayoría de los laboratorios de Farmacología, algunas de ellas tienen un componente importante de crueldad y son de poca aceptación por algunos de los estudiantes. Una de las prácticas que no se puede aceptar es la determinación de la dosis letal 50 (DL 50 ) en ratas o ratones, cuya utilidad está en duda como parámetro para estimar la seguridad de los fármacos y sustancias nuevas. Es obvio que el uso de animales era el único método del que disponían los profesores hace algunos años para enseñar esta materia. Pero en los últimos años el avance de la informática, de las tecnologías de la imagen y la disposición de líneas celulares ha permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de los animales para lograr los objetivos docentes que se plantean en las prácticas de laboratorio de Farmacología (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003; Eder et al., 2006). Los métodos utilizados en la investigación, para la evaluación de la seguridad y/o toxicidad y en la enseñanza están en continuo progreso, ya que los científicos están en permanente búsqueda de posibles alternativas que mejoren la calidad de su trabajo. Ello es debido, en parte, a la lógica evolución de los conocimientos científicos y de sus aplicaciones tecnológicas y, en parte, a consideraciones éticas, logísticas, económicas, sociopolíticas y legales (Sterling y Rispin, 2002). El número de animales utilizados en Europa con fines educativos es relativamente pequeño comparado con el total empleado en investigación y se ha venido reduciendo en los últimos años, pero a pesar de ello todavía se puede reducir más. En México, el uso de animales en docencia es alto, aunque no se cuenta con datos precisos de cuántos se sacrifican en cada ciclo escolar. Por otro lado, la aplicación de la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) ha sido lenta en los laboratorios de enseñanza de las Ciencias Biomédicas. En cambio, en el artículo 25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se especifica: aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos. En las legislaciones relacionadas con la protección de los animales de todos los países de la Comunidad Europea se considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (Russell y Burch, 1959). Este principio indica 12 Dr. Andrés Navarrete Castro la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el nuevo sistema aporte el mismo grado de información, de Reducir el número de animales de experimentación cuando su uso sea necesario y se presente como el único método válido y, finalmente, de Refinar las técnicas empleadas con los animales, con el fin de mejorar su eficacia o disminuir el dolor o el grado de sufrimiento infligido (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003). En el caso de la docencia, se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los procedimientos propuestos se pueden citar: a) Modelos, maniquíes y simuladores mecánicos. b) Películas y videos. c) Simulaciones de ordenador y sistemas de realidad virtual. d) Autoexperimentación en el propio individuo. e) Experimentos con vegetales, incluyéndose hongos y algas. f) Uso de material procedente de los rastros. g) Estudios in vitro con líneas celulares, organismos inferiores como bacterias, nematodos, insectos o peces en etapa temprana. h) Aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un procedimiento científico (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003). En el Laboratorio de Farmacología I se plantea el desarrollo de procedimientos experimentales y actividades en los que, bajo el principio de las tres erres, se reduzca, se reemplace y se refine el uso de animales de laboratorio para cubrir los objetivos de la enseñanza experimental de la Farmacología. Considerando lo anterior, en el laboratorio de Farmacología se realizarán actividades de distintos tipos: 1) Simulaciones. Se realizarán recreaciones en la computadora que permita a los estudiantes la comprensión de aspectos que, sin la necesidad de repetir muchos experimentos, puedan comprender los conceptos y los procedimientos para definir parámetros farmacológicos. 2) Prácticas. Desarrollo de prácticas sencillas, con lo que se pretende conozcan técnicas y hábitos del laboratorio de Farmacología. 3) Demostraciones. En esta categoría se realizan experimentos, que debido a las siguientes razones no es posible que la realicen los estudiantes en forma individual o en grupos pequeños: a. El experimento requiere de cierta destreza que en una o dos sesiones no es posible que las aprenda el estudiante. b. La existencia de equipo de laboratorio en número reducido. c. El tiempo limitado para la sesión de laboratorio. 4) Autoexperimentación. Sin poner en riesgo en ningún grado la integridad y la salud de los estudiantes, se realizará una práctica para observar algunos procesos farmacocinéticos de un fármaco (Ácido acetilsalicílico). Cualquiera que sea la modalidad que se realice, cada uno de ellos debe comprender las siguientes partes: Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 13 familiarización, ejecución y discusión del procedimiento. Con ello se pretende: Bibliografía Facilitar el aprendizaje de los aspectos fundamentales de la Farmacología. Familiarizar a los estudiantes con el método científico en experimentos de esta disciplina. Enseñar técnicas y hábitos del laboratorio de Farmacología. Motivar a los futuros farmacéuticos hacia la investigación y el estudio de la Farmacología como área de desarrollo profesional. Eder C, Falkner E, Nehrer S, Losert U y Schoeffl H. (2006). Introducing the concept of the 3Rs into tissue engineering research. Altex-Alternativen Zu Tierexperimenten. 23: Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE. Londres. Meyer B, Ferrigni N, Putnam J, Jacobsen L, Nichols D, McLaughlin J. (1982). Brine Shrimp: A convenient general bioassays for active plant constituents. Planta Medica. 45: Russell W, Burch R. (1959). The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen, Londres. Tallarida R. (2000). Drug synergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC. EUA. Van der Valk J, Dewhurst D, Hughes I, Atkinson J, Balcombe J, Braun H, Gabrielson K, Gruber F, Miles J, Nab J, Nardi J, Van Wilgenburg H, Zinko U y Zurlo J. (1998). Alternatives to the use of animals in higher education. ATLA 27:39-52 Vinardell P. (2003). Alternativas al uso de animales de experimentación en las prácticas de fisiología. Boletín de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas. 6 (1). 2. Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50 en un sistema simulado Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis). Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal. I. Introducción Dentro de las Ciencias Biológicas, entre ellas la Farmacología, los animales muchas veces tienen un papel central en las clases prácticas en el laboratorio. Cientos de millones son usados para experimentos o sacrificados para su disección cada año en todo el mundo. La visión actual del uso de animales es una educación completamente humana, donde los objetivos de la enseñanza son alcanzados usando métodos alternativos, y donde la compasión, el respeto a la vida y el pensamiento crítico son valorados y desarrollados. Es una visión donde los alumnos tienen libertad de conciencia y la relación negativa con los animales ha sido transformada al pensamiento positivo en lugar de hacer un uso dañino (Jukes y Chiuia, 2006). Un gran número de compuestos y fármacos cuenta con la determinación experimental de los valores de dosis efectiva 50 (DE 50 ), dosis tóxica 50 (DT 50 ) y dosis letal 50 (DL 50 ). El cálculo de este parámetro se puede predecir mediante ecuaciones que explican el fenómeno farmacológico (Tallarida, 2000). Utilizando los valores descritos en la literatura es posible simular la adición de diferentes dosis o concentraciones de diferentes fármacos en un sistema en computadora, donde el alumno podrá construir curvas dosis-respuesta y, por lo tanto, determinar la DE 50, sin el uso de animales de laboratorio. II. Objetivos Los objetivos de esta práctica son: 1. Determinar la ventana de actividad biológica de fármacos mediante el uso de un sistema simulado. 2. Aprender el uso de un sistema simulado en computadora. 3. Calcular la DE 50 de una serie de fármacos por medio de la ecuación de Hill, con los datos obtenidos en el sistema simulado. III. Material a) Software Se utilizará el software SimCDR ver. 1.0 desarrollado ex profeso para la práctica por el M en C José Luis Balderas, de la Facultad de Química de la UNAM. El software puede ser descargado del siguiente vínculo: Este programa deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 o posterior. 16 Dr. Andrés Navarrete Castro IV. Procedimiento a) Manejo del software SimCDR ver. 1.0 Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente: 1) Inicio del programa y ejecución de un nuevo experimento simulado. a) Para iniciar el programa se deben oprimir los siguientes iconos: b) En la casilla de Fármaco se selecciona el fármaco que se utilizará en la simulación. En la ventana Información del fármaco aparecerán una breve descripción del mismo, así como su actividad farmacológica más importante. c) Se selecciona el número de dosis así como las unidades que se emplearán, en las casillas Núm. de dosis y Unidades, respectivamente. d) Se llenan las casillas que aparecen en la ventana Dosis a probar y se oprime el botón Calcular el % de efecto. Si alguna de las casillas anteriores está en blanco, aparecerá un mensaje de error. e) En la ventana Resultados aparecerán las dosis que se administraron simuladamente y los porcentajes de respuesta que darían. f) Para iniciar un nuevo experimento simulado, se deberá oprimir el botón Borrar datos o, si se prefiere, cambiar los datos en las casillas correspondientes. Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 17 V. Análisis de Resultados 1. Con los datos obtenidos en los experimentos simulados: a) Construir las curvas dosis-respuesta de los fármacos utilizados. b) Calcular la DE 50 para la actividad principal de los fármacos utilizados mediante la Ecuación de Hill. VI. Bibliografía Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC. EUA. Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE. Londres. 3. Determinación de la concentración letal 50 (CL 50 ) del dicromato de potasio en Artemia salina Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal. I. Introducción Un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos; a su vez, se puede señalar como cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de la respuesta biológica que produce. La relación entre la respuesta biológica y la dosis o la concentración de una sustancia activa se relaciona en la llamada curva dosis-respuesta. Esta vinculación puede darse de forma graduada o la respuesta puede ser de tipo todo o nada, también conocida como cuantal. En esta práctica se realizará un experimento en que se analizará el segundo tipo de relación curva dosisrespuesta, es decir, se analizará la curva dosis-respuesta cuantal, que debido a la forma en la que se realizará, propiamente se debe referir como la curva concentración-respuesta cuantal. Se utilizará como sistema biológico el crustáceo Artemia salina en su forma adulta y como larva o nauplio, y como sustancia de prueba al dicromato de potasio. II. Objetivos Los objetivos de esta práctica son: 1. Manejar un sistema biológico alterno a los mamíferos y roedores para la determinación de una curva concentración-respuesta cuantal. 2. Realizar el cálculo de la CL 50 mediante el análisis Probit. III. Material 1. Utilizando Artemia salina adulta. a) Material biológico De 100 a 200 ejemplares adultos de Artemia salina. b) Materiales, cristalería y equipo Un vaso de precipitado de 500 ml Una pipeta graduada de 2 ml Una pipeta volumétrica de 10 ml 20 Dr. Andrés Navarrete Castro 24 frascos viales marcados para un volumen de 5 ml Una lámpara de escritorio. Una Pipeta Pasteur con bulbo Aereador con manguera y filtro c) Reactivos 100 ml de disolución de dicromato de potasio, K2Cr 2 O 7 (50 mg/ml). Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 ml de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 ml con agua destilada. 2. Utilizando nauplios de Artemia salina. a) Material biológico Huevecillos liofilizados de Artemia salina. b) Materiales, cristalería y equipo Pecera de vidrio capacidad 2 L Pecera de 500 ml 24 frascos viales marcados para un volumen de 2 ml Pipetas de vidrio Jeringas de 1 ml Foco sumergible de 5 W Termómetro para pecera Matraz Erlenmeyer de 1 L Vasos de precipitados de 100, 500 ml Cinco Pipetas Pasteur con bulbo Aereador con manguera y filtro c) Reactivos 100 ml de disolución de dicromato de potasio, K2Cr 2 O 7 (50 mg/ml). Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 ml de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 ml con agua destilada. 100 ml de disolución de dicromato de potasio, K2Cr 2 O 7 (12.5 mg/ml). Disolver 1.25 g de dicromato de potasio en 50 ml de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 ml con agua destilada. 500 ml de agua de mar artificial. Disolver 16 g de sal marina (o en su defecto cloruro de sodio, NaCl) en 500 ml de agua y colocar dos gotas de anticloro. Dejar reposar por 10 minutos y filtrar si es necesario. Anticloro (tiosulfato de sodio, Na2S 2 O 3, al 1 %). Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 21 IV. Procedimiento 1. Utilizando la Artemia salina Adulta. a) Preparación de la Artemia salina 1) Mantener a la Artemia salina en el vaso de precipitado con aeración constante. 2) Por triplicado rotular los frascos viales con las siguientes concentraciones: 0, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 20 mg/ml y, coloque una marca a un volumen de 5 ml. 3) Colocar 10 artemias en cada vial con ayuda de la pipeta Pasteur como se muestra en la figura siguiente. Utilice la luz de una lámpara como fondo para facilitar el conteo. La cantidad total de agua que resulta de la adición de las artemias debe ser de aproximadamente 1 ml, si es necesario retire el excedente. Artemia Salina b) Adición del dicromato de potasio 1) Adicionar las siguientes cantidades de dicromato de potasio indicadas en la siguiente cuadro: Concentración (mg/ml) Volumen de la disolución de dicromato de potasio (ml) 0 (Control) 22 Dr. Andrés Navarrete Castro 2) Inmediatamente después de la adición de la solución de dicromato de potasio se incorpora la cantidad necesaria de la solución de agua de mar para llegar a un volumen final de 5 ml. 3) Dejar durante una hora en exposición bajo luz blanca. c) Lectura de resultados 1) Al término del periodo de exposición se contarán las artemias que sobrevivieron de la siguiente manera: a. Las artemias que presentan movimiento, aunque sea mínimo, se consideran vivas. b. Las artemias que permanecen inmóviles, se consideran muertas. 2. Utilizando nauplios de Artemia salina. a) Incubación de los huevecillos de la Artemia salina 1. Se arma el dispositivo de incubación como se muestra en la siguiente figura. Pecera con dispositivos de incubación (1), aeración (2) e iluminación (3). 2. Se colocan 300 ml de agua de mar artificial en la pecera de incubación. 3. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una temperatura de C y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubación. 4. Conectar los dispositivos de aeración y luz. 5. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubación con una espátula limpia y seca (aproximadamente 10 µg de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500 ml. Dejar incubar durante 48 h. b) Preparación de los viales y realización del experimento. A partir de este momento se seguirán los pasos a), b) y c) del experimento llevado a cabo con artemias adultas, colocando en lugar de éstas a los nauplios. Utilizar la disolución de 12.5 mg/ml de dicromato de potasio, las concentraciones finales serán 0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, y 5 mg/ml respectivamente. Manual de F
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