Aislamiento de Rhizobium

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  PROTOCOLOS AISLAMIENTO DE Rhizobium A PARTIR DE NÓDULOS 1. Lavar al grifo la raíz 2. Seleccionar los nódulos grandes y rosados 3. Esterilizar la superficie de los nódulos con HgCl2 al 2,5 % durante 2 min 4. Lavar cinco veces con agua estéril 5. Machacar los nódulos con una varilla de vidrio en una placa estéril 6. Sembrar con la misma varilla sobre placas con YMA 7. Incubar las placas 5 días a temperatura ambiente 8. Aislar las colonias por agotamiento en estría sobre placas con YMA ESTERILIZACI
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  PROTOCOLOS AISLAMIENTO DE  Rhizobium  A PARTIR DE NÓDULOS1 . Lavar al grifo la raíz 2 . Seleccionar los nódulos grandes y rosados 3 . Esterilizar la superficie de los nódulos con HgCl 2  al 2,5 % durante 2 min 4 . Lavar cinco veces con agua estéril 5 . Machacar los nódulos con una varilla de vidrio en una placa estéril 6 . Sembrar con la misma varilla sobre placas con YMA 7 . Incubar las placas 5 días a temperatura ambiente 8 . Aislar las colonias por agotamiento en estría sobre placas con YMA ESTERILIZACIÓN DE SEMILLAS Y GERMINACIÓN1 . Esterilizar la superficie de las semillas con HgCl 2  al 2,5 % durante 5 min 2 . Lavar repetidamente con agua estéril (x10) 3 . Colocar las semillas en placa con Rigaud sin nitrógeno 4 . Añadir 2 ml de H 2 O estéril 5 . Extender las semillas sobre la superficie de la placa 6 . Dejar reposar 5 min e invertir la placa 7 . Germinar en oscuridad a temperatura ambiente durante 2 días ENSAYO DE NODULACIÓN EN TUBO1 . Esterilizar semillas 2 . Germinar en placa con Rigaud sin nitrógeno a temperatura ambiente y oscuridad durante 2 días 3 . Colocar las semillas germinadas en tubos conteniendo 10 ml de medio de enraizamiento deRigaud y Puppo sin nitrógeno con una tira de papel de filtro de 15 x 1,5 cm como soporte 4 . Mantener en oscuridad y a temperatura ambiente durante 4 días 5 . Inocular  Rhizobium  (cultivos de 4 días en YMA) con 1mL de una suspensión de D.O. 600nm : 0,5 ensolución de enraizamiento 6 . Incubar en cámara iluminada a 24˚ C con un fotoperíodo de 16/8 7 . Contar los nódulos,cada 72 h, a partir de los cinco días de la inoculación. ENSAYO DE INFECTIVIDAD1 . Esterilizar semillas 2 . Germinar en placa con Rigaud sin nitrógeno a temperatura ambiente y oscuridad durante 2 días 3 . Colocar un papel de filtro estéril sobre la superficie de las placas con Rigaud sin nitrógeno 4 . Añadir 3 ml de H 2 O estéril a cada placa 5 . Colocar 5 plántulas por placa 6 . Inocular  Rhizobium  (cultivos de 3 días en YMA) con 1mL de una suspensión de D.O. 600nm : 0,5 ensolución de enraizamiento 7 . Sellar las placas y colocar en vertical en oscuridad y a temperatura ambiente durante 6 días 8 . Retirar las raíces y lavar con H 2 O destilada 9 . Teñir con 0,01% de Azul de Metileno durante 30'' 10 . Lavar con H 2 O destilada (x2) 11 . Observar al microscopio óptico de campo claro con objetivo 10x y 20x  Amplificación del 16S rDNA Bacteriano a partir de Células Bacterianas (Gram -)1 . Recoger una cantidad de células aproximadamente del tamaño de un grano de arroz,resuspender en 500 µl de agua destilada estéril y precipitar el “pellet” a 10,000 rpm / 5min. Retirar el sobrenadante. 2 . Añadir 200 µl de sarcosyl (0.1% en agua destilada) y resuspender suavemente. 3 . Centrifugar a 10-12,000 rpm / 5 min. Retirar el sobrenadante. 4 . Añadir 100 µl de NaOH (0.05 M), resupender las células y calentar a 100°C durante4-5 minutos. 5 . Añadir 700 µl de agua MiliQ estéril. 6 . Resuspender (invirtiendo suavemente el tubo Eppendorf) y centrifugar 4,000 rpm / 3min. 7 . Recoger 400 µl de sobrenadante y guardar a -20°C. 8 . PCRCantidad para 1 reacción:7µL Agua ultrapura estéril2,5µLPCR buffer 10x0,25µLdNTPs2,5µLPrimer UPSH1F2,5µLPrimer UPSH1R0,4µLAmplitaq polimerasa2µLMuestra1 ciclo95°C10min35 ciclos94°C1min58°C2min72°C1min1 ciclo72°C7minEnfriar a 4°C 9 . Preparar geles de agarosa al 1% en TAE 10 . Correr en geles de 10 cm durante 1,5 h a 6 V/cm 11 . Teñir con bromuro de etidio 30 min y desteñir en agua durante 5 min 12 . Observar a 355 nm  MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES DE ENRAIZAMIENTO YMAK 2 HPO 4 0,5 gMgSO 4  x 7 H 2 O0,2 gNaCl0,1 gManitol10 gExtracto de levadura0,5 gH 2 O destilada c.s.p.1 LAgar20 gRIGAUD y PUPPOKH 2 PO 4 0,2 gMgSO 4  x 7 H 2 O0,2 gEDTA férrico-sódico0,025 gNa 2 MoO 4 0,004 gH 3 BO 3 0,018 gMnSO 4  x 4 H 2 O0,02 gZnSO 4 0,003 gCuSO 4  x 5 H 2 O0,002 gH 2 O destilada c.s.p.1 L
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